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  • “以子之矛,攻子之盾”——分子植物科学卓越创新中心研发出一种利用跨界RNAi提高生防真菌杀虫效力的新方法

    文章来源:分子植物科学卓越创新中心  |  发布时间:2022-10-26  |  【打印】 【关闭

      

      2022年10月25日,中国科学院分子植物科学卓越创新中心王四宝研究组在国际学术期刊Cell Reports上在线发表了题为“Expression of mosquito miRNAs in entomopathogenic fungus induces pathogen-mediated host RNA interference and increases fungal efficacy”的研究论文。该工作研发出一种利用寄主昆虫来源的miRNA遗传改造生防真菌增强其杀虫效力的“以子之矛,攻子之盾”的新方法。

      昆虫通过取食作物或吸血给农业生产和人类健康造成严重危害。目前蚊虫等害虫的防治主要依赖化学农药,长期过量使用化学杀虫剂造成农药残留、害虫产生抗药性等问题,对粮食安全、人类健康和生态安全构成重大威胁。自然界,存在着许多天然对昆虫有致病作用的微生物,利用其致病性防治害虫是一种环境友好的绿色生物防治方法。病原真菌是昆虫病原微生物中的最大类群,是自然界中控制昆虫种群消长的重要因子,已经被开发成为化学农药的替代品,用于防治多种农业和卫生害虫,具有环境友好、害虫不易产生抗性、可持续控制能力强的优点。其中,白僵菌作为一种天然的昆虫病原真菌,能够通过体表侵染杀死寄主昆虫,对防治刺吸式口器的病媒昆虫(如蚊虫等)和农业害虫具有独特的优势,具有巨大的研究和开发价值,备受国内外学者及产业界的关注。

      然而,病原真菌一般杀虫时间长(一般需要一周甚至更长的时间),在很大程度上制约了真菌杀虫剂的广泛应用。这主要是由于昆虫在与病原菌长期攻防和博弈的过程中,进化出了高效的免疫防御系统以对抗病原菌的感染。遭到真菌侵染后,昆虫通过模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)激活Toll等免疫信号通路,产生抗菌肽抵御病原菌的感染,从而导致杀虫真菌击倒害虫时间较长。菌株遗传改良是提高杀虫真菌侵染和致病效力的有效手段,比如通过高表达外源毒素、毒力蛋白能够显著增强生防真菌杀虫效力,但效应蛋白作用靶标单一,还会导致靶标昆虫产生选择性压力。因此,需要开发多靶点、无选择压力、更加安全的效应因子用于生防菌的遗传改良。

      RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的一种基因转录后表达调控的保守机制。昆虫miRNA介导的RNA干扰在昆虫响应病原菌侵染的免疫反应中发挥重要作用。 研究团队前期研究发现,小RNA(small RNA, sRNA)可在蚊虫?病原真菌互作中进行双向传递,参与蚊虫免疫和病原真菌的致病过程,这种突破物种界限,跨物种转运到寄主或微生物细胞内干扰靶基因表达的现象,称为跨界RNA干扰(Cross-kingdom RNAi)。一方面,昆虫可以将自身保守的miRNA传递到病原真菌细胞来跨界抑制致病基因的表达,影响真菌致病性(Wang et al., 2021. PNAS);另一方面,病原真菌感染昆虫过程中,也能够将自身上调表达的sRNA递送到昆虫细胞内跨界干扰寄主免疫基因的表达(Cui et al., 2019. Nature Communications)。这些发现提示或许可以利用sRNA在病原菌与昆虫互作过程中跨界调控的功能,使其成为高效的效应因子对杀虫真菌进行遗传改良。

      该研究首先筛选鉴定到来源于埃及伊蚊的负向调节自身免疫的两个miRNAs (miR-8和miR-375),并成功构建表达伊蚊miRNAs的球孢白僵菌工程菌株。工程菌株在感染蚊虫过程中能够产生大量miR-8或miR-375,这些miRNAs能够从真菌细胞跨界转运到感染的蚊虫细胞内,分别靶向沉默伊蚊抗真菌免疫Toll通路中的Toll5B和Rel1A基因,同时激活Toll通路抑制因子Cactus的转录表达,从而抑制蚊虫抗菌肽基因的表达,显著降低蚊虫抗真菌免疫反应,进而增强真菌对蚊虫的致病力和加快蚊虫死亡速度,将白僵菌感染蚊虫的半数致死时间(LT50)缩短15~20%。进一步研究发现,表达寄主miRNA的工程菌株对抗多种杀虫剂的野生埃及伊蚊同样展现出更强的杀虫效果,缩短半数致死时间(LT50)达30%左右。分析发现miR-8和miR-375在埃及伊蚊、冈比亚按蚊、小菜蛾等多种害虫中序列保守,靶基因预测分析发现其均可靶向这些害虫的Toll免疫信号通路相关基因。毒力测试发现,表达miR-8或miR-375的菌株对鳞翅目害虫大蜡螟具有较强的致病力。与野生型菌株相比,表达miR-8或miR-375能显著加速白僵菌对大蜡螟的击倒时间,半数致死时间LT50缩短20%~40%,且共表达miR-8和miR-375对菌株杀虫效力有显著增效作用。

      研究团队将利用“以子之矛,攻子之盾”的策略构建表达昆虫来源miRNA的工程菌株,通过跨界RNA干扰害虫基因的表达来提高生防菌毒力的新方法称为病原菌介导的RNAi(pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)(图1)。该方法具有以下多重优点:1)与靶标单一的杀虫毒蛋白相比,miRNA具有多靶标特性,单个miRNA可以在一个或多个途径中靶向多个基因来发挥其生物学功能,此外,单个靶基因也可受到多个miRNAs的组合调控;2)理论上,一个菌株中可表达多个寄主miRNAs,实现对害虫免疫或其他生理过程的重要靶基因或通路进行操纵,进一步提高真菌杀虫剂的防效,使得该方法在生防菌的遗传改良上具有巨大的应用潜力;3)某些昆虫来源的miRNAs具有种属特异性,可通过定制害虫特异的miRNA提高工程菌的寄主靶向性和特异性;4)使用寄主来源的miRNA进行菌株改良可以避免害虫产生选择压力,因为昆虫对自身免疫和生理健康至关重要的内源性miRNA不易产生选择抗性;5)相比于外源毒素或毒蛋白基因,使用害虫自身的miRNA可以消除公众对于工程菌株生物安全性的担忧。本研究提出“以子之矛,攻子之盾”的策略,利用丰富的寄主miRNAs改造生防菌,为开发安全和高效的真菌等生物杀虫剂开辟了新方向和新思路,为蚊虫和其他害虫的绿色防治提供了新工具。

      中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士后崔春来和已毕业博士研究生王燕为该论文的共同第一作者,王四宝研究员和上海科技大学刘竞男副研究员为共同通讯作者,中心博士研究生李祎斐、孙佩璐和云南省寄生虫病防治所周红宁主任技师和姜进勇副主任医师参与了该项目研究。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划和中国博士后科学基金等项目的资助。

      论文链接:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111527


    图1. 利用病原菌介导的RNAi (pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)提高生防真菌杀虫效力

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